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丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒

操作步驟：

一、樣本的前處理

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10 4個）提取液體積（mL）為 500-1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或者 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

二、測定步驟及加樣表：

1. 分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長 340nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定

（1） 在試劑二瓶中加入 17ml 試劑一和 1ml 蒸餾水充分溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃ （其他物種）水浴 5 分鐘，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2） 在試劑三中加入 1ml 蒸餾水充分溶解，冰上放置備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑三和 180μL 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，計算△A=A1-A2.

PK 活性計算： A．用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、 血清（漿）PK 活力的計算：單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/mL）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷V 樣÷T=1608×△A

2、 組織、細菌或細胞中 PK 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/mg prot）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=1608×△A ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/g 鮮重）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×△A ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.216×△A V 反總：反應體系總體積，2×10 -4L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光徑， 1 cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

B．用 96 孔板測定的計算公式如下：

1、 血清（漿）PK 活力的計算：單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/mL）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷V 樣÷T=3216×△A 2、 組織、細菌或細胞中 PK 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/mg prot）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=3216×△A ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/g 鮮重）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=3216×△A ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個酶活力單位。 PK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.432×△A V 反總：反應體系總體積，2×10 -4L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，2min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

相關文獻：

《Galangin and Pinocembrin from Propolis Ameliorate Insulin Resistance in HepG2 Cells via Regulating Akt/mTOR Signaling》 作者:Yinkang Liu, Xiali Liang,Gensheng Zhang,Lingjie Kong,Wenjun Peng and Hongcheng Zhang 期刊:Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 影響因子:1.984 PMID:30420897
 

丙酮酸激酶(PK)活性檢測試劑盒

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 20 mL×1 瓶，4℃保存；試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；試劑三：液體×1 支，4℃保存；